Die let-7-Familie von microRNAs unterdrückt die Immunumgehung bei Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinomen durch Förderung des PD-L1-Abbaus

Ethikerklärung

Die aktuelle Studie wurde mit Genehmigung der Ethikkommission des Zweiten Krankenhauses der Universität Jilin durchgeführt. Schriftliche Einwilligungsdokumentationen wurden von allen Teilnehmern vor dem Experiment eingeholt. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Grundsätzen und Verfahren des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der National Institutes of Health durchgeführt.

Studienteilnehmer

HNSCC–Gewebe und angrenzende normale Gewebe (über 0,5-1 cm vom Tumor entfernt) wurden von 37 HNSCC-Patienten gesammelt, die zuvor zwischen Januar 2011 und Dezember 2013 einer kontinuierlichen chirurgischen Resektion unterzogen worden waren. Alle Patientendaten wurden in Übereinstimmung mit den pathologischen Gewebeproben aufgezeichnet, wobei ein Teil der Proben einer vollständigen mRNA-Extraktion unterzogen wurde. Die gesammelten pathologischen Proben wurden mit neutral gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und anschließend zu Schnitten präpariert.

Histopathologische Diagnosen und Klassifikation von HNSCC gemäß der Klassifikation von Tumoren des Verdauungssystems der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Darüber hinaus wurden Patienten mit oder ohne Lymphknoten / vaskulärer Tumorthrombus / perineurale Invasion / extraösophageale Invasion bewertet, wobei die klinischen Daten der Patienten einschließlich Geschlecht, Alter, Tumorgröße und prognostische Informationen bestätigt und auf einem Krankenaktenblatt aufgezeichnet wurden.

Immunhistochemische Färbung

Die Schnitte wurden konventionell mit Xylol entwachsen, mit Gradientenalkohol (absoluter Ethylalkohol, 95%iger Alkohol und 75%iger Alkohol, je 3 min) dehydratisiert, mit Citrat-Reparaturlösung im Schnellkochtopf ausgebessert, 1,5 min bei hoher Temperatur gekocht und schließlich auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Als nächstes wurden die Abschnitte mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gespült, wobei 50 µL 3% H2O2 zu Inkubationszwecken für eine Dauer von 20 min zu den Abschnitten gegeben wurden, um die endogene Peroxidaseaktivität zu eliminieren. Nach einer weiteren PBS-Spülung wurde jeder Sektion programmierter Death-Ligand 1 (PD-L1) (ab213524, Rabbit, Abcam, Shanghai, China) oder Transkriptionsfaktor 4 (TCF-4) (ab185736, Rabbit, Abcam, Shanghai, China) zur Inkubation bei 4°C über Nacht zugesetzt, wobei normales Kaninchenserum anstelle des Primärantikörpers als Negativkontrolle diente. Nach PBS-Spülen wurde jeder Abschnitt mit 50 µL Polymerverstärkungsmittel bei 37 ° C für 20 min inkubiert, gefolgt von einer zusätzlichen PBS-Spülung und Inkubation mit 50 µL enzymmarkiertem Kaninchen-Antipolymer bei 37 ° C für 30 min. Jeder Abschnitt wurde zweimal mit PBS weitergespült (jeweils 10 min), gefolgt von tropfenweiser Zugabe von 100 µL (oder 2 Tropfen) frisch hergestelltem 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) zur Entwicklung. Anschließend wurden die gefärbten Schnitte unter einem Lichtmikroskop (CX41-12C02, Olympus Optical Co., Tokio, Japan), mit brauner Färbung, die eine positive Färbung widerspiegelt. Abschließend wurden die Schnitte mit destilliertem Wasser gespült, mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit Gradientenalkohol (75%iger Alkohol, 95%iger Alkohol und absoluter Ethylalkohol, je 3 min) dehydratisiert, in neutralem Balsam montiert und unter dem Mikroskop beobachtet.

Die Tumorzellen mit braun-gelben Feinpartikeln wurden als Zellen mit positiver Expression von PD-L1 und TCF-4 angesehen. In Bezug auf die positiven Zellen wurden die Zellen wie folgt bewertet: positive Zellen ≤10% wurden als 0 Punkte, 11-51% als 2 Punkte, 51-81% als 3 Punkte und ≥ 81% als 4 Punkte bewertet. Bezüglich der Färbungsintensität wurden die Zellen wie folgt bewertet: Schwache Intensitätsexpression wurde als 1 Punkt, moderate Intensitätsexpression als 2 Punkte und hohe Intensitätsexpression als 3 Punkte bewertet. Die positiven Zellen ≤10% (0 Punkte) wurden als negativ (−), 3 Punkte als schwach positiv (+), 4-5 Punkte als positiv (++) und 6-7 Punkte als stark positiv (+++) angesehen.

Zellkultur

Für die aktuelle Studie wurden die 293 T-Zellen (Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) und die FADU-, Cal127- und SCC7-Zellen (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) eingesetzt. Zunächst wurden die 293 T-, FADU- und Cal27-Zellen mit Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) (12800017, Gibco Company, Grand Island, NY, USA) kultiviert, das 1,5 g/L NaHCO3, 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin enthielt. Währenddessen wurden die SCC7-Zellen mit Royal Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (31800022, Gibco Company, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit 1,5 g/L NaHCO3, 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin, kultiviert. Das Medium wurde auf eine aseptische Tischplatte gestellt, wobei 5 ml des Mediums unter Verwendung eines sterilen Pasteur-Röhrchens extrahiert wurden, das dann in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben wurde. Als nächstes wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff ausgewählt und in ein Wasserbad bei 37 ° C getaucht, um ein schnelles Auftauen zu ermöglichen. Die Zellen wurden dann mit einem Pasteur-Röhrchen extrahiert und in ein 15-ml-Röhrchen gegeben und 5 min bei 800 u / min zentrifugiert, gefolgt von der Entfernung des Überstandes und der Resuspendierung mit 1 ml Medium. Zuletzt wurde die Zellsuspension in eine 6 cm große Kulturschale überführt, mit 2 ml Medium versetzt und anschließend in einem Inkubator bei 37°C mit 5% CO2 in Luft kultiviert. Das Zellwachstum wurde am folgenden Tag analysiert, wobei das Zellmedium alle 1-2 Tage erneuert wurde.

Zellbehandlung

Die Kernplasmide LV3 und pBABE (beide mit Puromycin-Resistenzgen) überexprimierten let-7a, let-7b, Luciferase, flag-Ub und TCF-4 (Cyagen Biosciences Inc. Guangzhou, China) sowie die Packaging Plasmide pVSVG, pMDL, pREV und PIK wurden in DH5a-kompetente Zellen transferiert. Ein Plasmid-Extraktionskit (DP103-03, TIANGEN Biotechnology Co. Ltd., Peking, China) zur entsprechenden Plasmidextraktion eingesetzt. Die extrahierten Plasmide wurden mit dem Turbofect-Transfektionsreagenz (R0531, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) in 293 T-Zellen transfiziert, wobei das Medium 12 h später gewechselt wurde und das Medium zu den Zeitpunkten 24 h bzw. 48 h entnommen wurde. Das gesammelte Medium wurde unter Verwendung eines 0,22 µm Siebgewebes filtriert, um Virus zu erhalten, das verwendet wurde, um die HNSCC-Zelllinien zu infizieren. Puromycin (2 µg /ml) wurde im Screening-Prozess der Zelllinien angewendet, die let-7a, let-7b, flag-Ub und TCF-4 stetig überexprimierten. G418 (300 µg/ml) wurde angewendet, um die stabile Zelllinie mit Luciferase zu screenen.

Reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Der Gesamt-RNA-Gehalt wurde in strikter Übereinstimmung mit den Anweisungen des Trizol-Kits (15596-018, Beijing Solarbio Life Sciences Co., Ltd., Peking, China), gefolgt von RNA-Konzentrationsbestimmung. Gemäß den Anweisungen der einstufigen Methode miRNA Reverse Transkription Kit (D1801, HaiGene, Harbin, China) und komplementäre DNA (cDNA) Reverse Transkription Kit (K1622, Beijing Yaanda Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China) wurde RNA in cDNA reverse transkribiert, wobei die Reaktionsbedingungen wie folgt waren: bei 42°C für 30-50 min (Reverse Transkription) und bei 85°C für 5 s (Reverse Transkriptase Inaktivierung). Die cDNA wurde auf 50 ng/µl verdünnt und anschließend für RT-qPCR eingesetzt. Das Reaktionsamplifikationssystem wurde auf 25 µL eingestellt, wobei jeweils 2 µL zugegeben wurden. Ein Fluoreszenzquantifizierungs-PCR-Instrument (VIIa 7, Daangene Co., Ltd. der Sun Yat-Sen University, Guangzhou, China) wurde für RT-qPCR-Zwecke eingesetzt, wobei die Reaktionsbedingungen wie folgt eingestellt wurden: Vordenaturierung für 4 min bei 95°C, 30 Zyklen Denaturierung für 30 s bei 95°C, Annealing für 30 s bei 57°C und Extension für 30 s bei 72°C. Zwei µg Gesamt-cDNA wurden als Templet verwendet, während U6 als interne Kontrolle angesehen wurde. Die relative Expression der Zielgene wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode berechnet, bei der ΔΔCt = ΔCt (Versuchsgruppe) – ΔCt (Kontrollgruppe) und ΔCt = Ct (Zielgene) – Ct (U6). Der Versuch wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um den Mittelwert zu erhalten (Tabelle 1).

Tabelle 1: Primersequenzen für RT-qPCR

PD-L1-Glykosylierungstest

Um festzustellen, ob PD-L1 glykosyliert wurde, wurde ein Radio-Immunopräzipitations-Assay (RIPA) -Lysat (P0013B, Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) auf Lyse FADU- und Cal27-Zellen angewendet, die dann mit PNGase F (G5166-50UN, Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO, USA) inkubiert und zentrifugiert wurden. Springer springer 12000 r / min für den Proteingehalt zu extrahieren. Als nächstes wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, um die mit PNGase F verbundenen Auswirkungen auf PD-L1 zu untersuchen. Zur Beurteilung des Abbaus von PD-L1 nach Glykosylierung wurde zur Behandlung der Zellen Tunicamycin (654 380, Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA) eingesetzt. Anschließend wurden 20 µM Cycloheximid (CHX) (HY-12320, MedChemExpress, MedChemExpress, USA) zu FADU- und Cal27-Zellen gegeben, um die Proteinsynthese zu inhibieren. Die Extraktion des Proteingehalts wurde bei 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h und 16 h durchgeführt, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse zur Bewertung der Expression von PD-L1. Schließlich wurde eine Degradationskurve von PD-L1 aufgetragen.

Peripheral blood monouclear cells (PBMC)-mediated cancer cell killing assay

Nach Mischen von Interleukin-2 (IL-2) (20 IU ml-1) mit PBMCs (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) wurden HNSCC-Zellen (1 × 106) 4 Tage lang mit PBMCs (1 × 107) kokultiviert, gefolgt von Isolierung der aktivierten PBMCs unter Verwendung eines Percoll-Dichtegradienten zentrifugation. Die HNSCC-Zellen FADU und Cal27 wurden mit CellTrace (Far Red, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) markiert und anschließend mit aktivierten PBMCs in einem Medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada), das humanen CD3/CD28-Tetramer-Antikörper-Komplex enthielt, in Polystyrolröhrchen (FALCON, Kanada) für 48 h bei 37°C mit 5% CO2 in Luft kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gespült, fixiert und permeabilisiert, gefolgt von einer Reparatur mit Fix/Perm-Lösung (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Die Zellen wurden dann mit V450-gespaltenem Caspase 3-Antikörper (560,627, Verdünnungsverhältnis von 1) gefärbt: 50, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) und mit BD FACS Canto II (BD Immunocytometry Systems, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) analysiert. Die HNSCC-Zellen wurden aus dem HNSCC/PBMC-Zellgemisch durch Gating für den CellTrace+ isoliert. Schließlich wurden die aktivierten PBMC-vermittelten Killer-HNSCC-Zellen analysiert, indem das Signal der V450-gespaltenen Caspase 3 detektiert wurde.

Dual-Luciferase Reporter Gene Assay

Synthetische TCF-4 3′ untranslated Region (UTR) Genfragmente wurden in den Renilla Luciferase Reporter stromabwärts des psiCheck2 Vektors (Promega, Madison, WI, USA) unter Verwendung der SgfI und PmeI Restriktionsstellen eingeführt. Anschließend wurden die Sequenzen des Wildtyps (WT) und des Mutantentyps (MUT) in TCF entworfen, wonach die Zielfragmente von WT und MUT unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in den psiCheck2-Vektor inseriert wurden. Anschließend wurden die korrekt sequenzierten Luciferase-Reporterplasmide TCF-4 3′-UTR WT und TCF-4 3′-UTR MUT mit let-7a/b in HEK-293 T-Zellen transfiziert (CRL-1415, Shanghai Xin Yu Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Nach 48 h wurden die Zellen gesammelt und entsprechend lysiert. Luciferase-Nachweis-Kits (RG005, Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) wurden eingesetzt, um die relative Luciferaseaktivität auf Glomax20/20 Luminometerfluoreszenz nachzuweisen. Jedes Experiment wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um den Mittelwert zu erhalten .

Western-Blot-Analyse

Zellen in jeder Gruppe wurden ausgewählt, zweimal mit PBS gespült, gefolgt von der Zugabe von RIPA-Lysepuffer (enthaltend Phenylmethansulfonylfluorid und Phosphatase-Inhibitor) und kontinuierlichem Schütteln. Anschließend wurden die Zellen bei 12000 U/min für 30 min bei 4°C zentrifugiert, wobei der Überstand entsprechend erhalten wurde. Nach Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration mittels Bicinchoninic acid Assay Kits (BCA) wurden 50 µg Proteine in 2 × Natriumdodecylsulfat (SDS) Beladungspuffer gelöst, 5 min bei 100°C gekocht, mit 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS-PAGE) abgetrennt und im Wet-Transfer-Verfahren auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran übertragen. Anschließend wurde eine Membranblockade für 1 h mit 5% Magermilchpulver bei Raumtemperatur durchgeführt. Anschließend wurde die Membran mit Primärantikörpern PD-L1 (ab213524, Verdünnungsverhältnis 1) inkubiert: 1000, Kaninchen), β-Catenin (ab32572, Verdünnungsverhältnis von 1: 1000, Kaninchen), T-Zellfaktor 4 (TCF-4) (ab185736, Verdünnungsverhältnis von 1: 1000, Kaninchen), STT3A (ab242223, Verdünnungsverhältnis von 1: 1000, Kaninchen), STT3B (ab122351, Verdünnungsverhältnis von 1: 1000, Kaninchen) und β-Aktin (ab8226, Verdünnungsverhältnis 1: 1000, Maus). Alle oben genannten Antikörper wurden von Abcam Inc. gekauft. (Cambridge, Vereinigtes Königreich). Nach drei Spülungen mit tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween-20 (TBST) wurde die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP) -markiertem Sekundärantikörper (oder Ziegen-Anti-Maus oder Ziegen-Anti-Kaninchen, Beijing TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China) für 1 h. Anschließend wurde die Membran erneut 3 mal mit TBST gewaschen, entwickelt unter Verwendung von Enhanced Chemiluminescence (ECL) Fluorescence Detection Kits (BB-3501, Amersham Pharmacia Biotech, Inc. Cambridge, UK) und fotografiert mit dem Bio-Rad Image Analysis System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Die Menge Ein v4.6.2 Software wurde verwendet, um die relative Proteinexpression zu analysieren, die als das Verhältnis des Grauwerts der entsprechenden Proteinbanden zur β-Aktin-Proteinbande ausgedrückt wurde). Der Versuch wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um den Mittelwert zu erhalten.

Subkutane Xenotransplantatmodelle bei Mäusen

Die C3H-Mäuse (im Alter von 6 Wochen, mit einem Gewicht von 18-22 g) wurden von Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd. In: Shanghai, China. Insgesamt 1 × 106 SCC7-Zellen, die Luciferase in der logarithmischen Wachstumsphase enthielten, wurden in 200 µL reinem DMEM resuspendiert und anschließend in beide ventralen Seiten der Mäuse injiziert. Nach der Tumorbildung wurden alle Mäuse in 4 Gruppen eingeteilt, basierend auf der Injektion mit normalen SCC7-Zellen, SCC7-Zellen, die Let-7a überexprimieren, normalen SCC7-Zellen, die mit CTLA-4-Antikörper (BE0032, Bio X cell, 1 mg / ml) kombiniert wurden, und SCC7-Zellen, die Let-7a überexprimieren, kombiniert mit CTLA-4-Antikörperbehandlung. Die Tumorgröße wurde gleichmäßig alle 5 Tage gemessen, mit Tumorvolumen = L (Länge) × W (Breite) 2/2. Anschließend wurde den Mäusen ventral D-Luciferin (122799-5, PE, 15 µg/Maus) injiziert, mit Isofluran betäubt und entsprechend beobachtet. Die Tumore wurden 20 Tage später gesammelt und das Volumen und Gewicht der Tumore verglichen und aufgezeichnet. Tumor Dissociation Kits (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) und ein Tumor infiltrating lymphocyte (TIL) gentleMACS Dissociation Instrument (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) wurden zur Herstellung von TIL und der Gradient Percoll II Flüssigkeit (GE Healthcare, Bostan, USA) verwendet. Die Dichtegradientenzentrifugationsmethode wurde angewendet, gefolgt von Isolierung der TILs aus der Tumorsuspension und durchflusszytometrischer Analyse. Die Tumorgewebe in TIL ohne Isolierung wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten und einem Immunfluoreszenz-Assay zur PD-L1-Expressionsanalyse unterzogen (64.988, Kaninchen, Verdünnungsverhältnis 1: 200, Cell Signaling, Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA), CD8 (ab22378, Ratte, Verdünnungsverhältnis 1: 200, Abcam, Cambridge, USA) und Granzyme b (AF1865, Ziege, Verdünnungsverhältnis 1: 100, R&D Systems, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Immunhistochemie wurde schließlich angewendet, um die Expression von TCF-4 zu untersuchen.

Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden zu einer Einzelzellsuspension präpariert und in Färbepuffer resuspendiert (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). FADU- und Cal27-Zellen wurden mit APC-PD-L1 (329.708, Maus, Verdünnungsverhältnis 1:50, BioLegend, San Diego, CA, USA) behandelt. Die Scc7-Zellen wurden mit BV421-PD-L1 (BioLegend, #124315, Rat. verdünnungsverhältnis von 1: 100), PerCP-CD3 (100.326, armenischer Hamster, Verdünnungsverhältnis von 1: 100, BioLegend, San Diego, CA, USA), APC / Cy7-CD8a (100.713, Ratte, Verdünnungsverhältnis von 1: 100, BioLegend, San Diego, CA, USA) und fixiertes und permeabilisiertes Pacific blue-IFNy (505.817, Ratte, Verdünnungsverhältnis 1:50, BioLegend, San Diego, CA, USA). Zuletzt wurden die Zellen mit einem BD FACS Canto II Durchflusszytometer (BD Immunocytometry Systems, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) analysiert und mit der Flow Jo Software analysiert.

Statistische Analyse

Alle experimentellen Daten wurden mit der Statistiksoftware SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) verarbeitet. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.

Wenn die Daten der Normalverteilung und der Homogenität der Varianz entsprachen, wurden die paarweise entworfenen Daten zwischen zwei Gruppen unter Verwendung eines gepaarten T-Tests und ungepaart entworfener Daten mit ungepaartem t-Test verglichen. Daten zwischen mehreren Gruppen wurden durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit einem Post-hoc-Test verglichen, der mit Tukeys durchgeführt wurde. Daten zu unterschiedlichen Zeitpunkten zwischen mehreren Gruppen wurden mit wiederholten ANOVA-Messungen analysiert, wobei Post-hoc-Tests mit Bonferroni durchgeführt wurden. Die Korrelation zwischen den Indikatoren wurde durch Pearson-Analyse analysiert. Ein Wert von p < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.