let-7-familien af mikroRNA’ er undertrykker immununddragelse i pladecellecarcinom i hoved og hals ved at fremme PD-L1-nedbrydning

etisk erklæring

den aktuelle undersøgelse blev udført med godkendelse af Etikudvalget for det andet Hospital, Jilin University. Der blev indhentet skriftlige informerede samtykkedokumenter fra alle deltagere inden eksperimentet. Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med principperne og procedurerne for vejledning til pleje og brug af laboratoriedyr af National Institutes of Health.

forsøgspersoner

hnscc–væv og tilstødende normale væv (over 0,5-1 cm væk fra tumor) blev opsamlet fra 37 hnscc-patienter, der tidligere havde gennemgået kontinuerlig kirurgisk resektion mellem januar 2011 og December 2013. Alle patientdata blev registreret i overensstemmelse med de patologiske vævsprøver, hvor en del af prøverne blev underkastet total mRNA-ekstraktion. De indsamlede patologiske prøver blev fikseret med neutralt bufret formalin, paraffinindlejret og efterfølgende fremstillet i sektioner.

histopatologiske diagnoser og klassificering af HNSCC overholdt Verdenssundhedsorganisationen (hvem) klassificering af tumorer i fordøjelsessystemet. Derudover blev patienter med eller uden lymfeknuder/vaskulær tumortrombe/perineural invasion/ekstraesophageal invasion evalueret med de kliniske data fra patienterne inklusive køn, alder, tumorstørrelse og prognostisk information bekræftet og registreret på et medicinsk journalark.

immunhistokemisk farvning

sektionerne blev konventionelt afvokset ved hjælp af ksylen, dehydreret med gradientalkohol (absolut ethylalkohol, 95% alkohol og 75% alkohol, 3 min for hver), repareret med citratreparationsopløsning i en trykkomfur, kogt ved høj temperatur i 1,5 min og fik til sidst lov til at køle ned til stuetemperatur. Derefter blev sektionerne skyllet med phosphatbuffer saltvand (PBS), med 50 liter på 3% H2O2 tilsat til sektionerne til inkubation i en varighed på 20 min for at eliminere endogen peroksidaseaktivitet. Efter en anden PBS-skylning blev hvert afsnit tilsat med programmeret død-ligand 1 (PD-L1) (ab213524, kanin, Abcam, Shanghai, Kina) eller transkriptionsfaktor 4 (TCF-4) (ab185736, kanin, Abcam, Shanghai, Kina) til inkubation ved 4 kg C natten over, med normalt kaninserum i stedet for primært antistof, der tjener som den negative kontrol. Efter PBS-skylning blev hver sektion inkuberet med 50 liter polymerforstærkende middel ved 37 liter C i 20 minutter efterfulgt af en yderligere PBS-skylning og inkubation med 50 liter-mærket kaninantipolymer ved 37 liter C i 30 minutter. Hver sektion blev yderligere skyllet to gange med PBS (10 min for hver), efterfulgt af dråbevis tilsætning af 100 liter (eller 2 dråber) frisklavet 3,3′-diaminobensidin (DAB) til udvikling. Derefter blev de farvede sektioner analyseret under et lysmikroskop (CKS41-12c02, Olympus Optical Co., Tokyo, Japan), med brun farve anses for at afspejle en positiv farvning. Endelig blev sektionerne skyllet med destilleret vand, modfarvet af hæmatoksylin, dehydreret med gradientalkohol (75% alkohol, 95% alkohol og absolut ethylalkohol, 3 min for hver), monteret i neutralt balsam og observeret under et mikroskop.

tumorcellerne, der præsenterede med brun-gule fine partikler, blev betragtet som celler med positiv ekspression af PD-L1 og TCF-4. I forhold til de positive celler blev cellerne scoret som fulgt: positive celler, der var 10%, blev scoret som 0 point, 11-51% som 2 point, 51-81% som 3 point og var 81% som 4 point. Med hensyn til farvningsintensitet blev cellerne scoret som følger: svag intensitetsekspression blev scoret som 1 point, moderat intensitetsekspression som 2 point og høj intensitetsekspression som 3 point. De positive celler med 10% (0 point) blev betragtet som negative (−), 3 point blev betragtet som svagt positive (+), 4-5 point blev betragtet som positive (++), og 6-7 point blev betragtet som stærkt positive (+++).

cellekultur

293 T-cellerne (Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) og FADU -, Cal127-og SCC7-cellerne (American Type Culture Collection , Manassas, VA, USA) blev ansat til den aktuelle undersøgelse. Oprindeligt blev cellerne 293 T, FADU og Cal27 dyrket med Dulbecco ‘s modified Eagle’ s medium (DMEM) (12800017, Gibco Company, Grand Island, NY, USA) indeholdende 1,5 g/l NaHCO3, 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. I mellemtiden blev scc7-cellerne dyrket med Royal Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (31800022, Gibco Company, Grand Island, NY, USA) suppleret med 1,5 g/L NaHCO3, 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Mediet blev anbragt på en aseptisk bænkplade med 5 mL af mediet ekstraheret under anvendelse af et sterilt Pasteurrør, som derefter blev tilsat til et 15 mL sterilt centrifugerør. Dernæst blev cellerne i flydende nitrogen udvalgt og nedsænket i et vandbad ved 37 liter C for at lette hurtig optøning. Cellerne blev derefter ekstraheret under anvendelse af et Pasteurrør og anbragt i et 15 mL rør og gennemgik centrifugering ved 800 r/min i 5 minutter efterfulgt af fjernelse af supernatant og resuspension under anvendelse af 1 mL medium. Endelig blev cellesuspensionen overført til en 6 cm kulturskål og tilsat med 2 mL medium og derefter dyrket i en inkubator ved 37 liter C med 5% CO2 i luft. Cellevækst blev analyseret den følgende dag med cellemediet fornyet hver 1-2 dag.

cellebehandling

kerneplasmiderne, LV3 og pBABE (begge indeholdende puromincinresistensgen) overudtrykt let-7a, let-7b, Luciferase, flag-Ub og TCF-4 (Cyagen Biosciences Inc. Plasmiderne pVSVG, pMDL, pREV og PIK blev overført til DH5a kompetente celler. Et plasmidekstraktionssæt (DP103–03, TIANGEN Biotechnology Co. Ltd., Beijing, Kina) blev anvendt til tilsvarende plasmidekstraktion. De ekstraherede plasmider blev transficeret til 293 T-celler ved anvendelse af Turbofect transfektionsreagens (R0531, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), med mediet ændret 12 h senere og medium opsamling ved henholdsvis 24 h og 48 h-tidspunkterne. Det opsamlede medium blev filtreret under anvendelse af et 0,22-liters sil-net for at opnå virus, som blev brugt til at inficere hnscc-cellelinjerne. Puromycin (2 liter/mL) blev anvendt i screeningsprocessen af cellelinjerne støt overeksprimerende let-7a, let-7b, flag-Ub og TCF-4. G418 (300 liter/mL) blev påført for at screene den stabile cellelinie indeholdende Luciferase.

omvendt transkription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-kpcr)

totalt RNA-indhold blev ekstraheret i nøje overensstemmelse med instruktionerne fra Trisol-kittet (15596-018, Beijing Solarbio Life Sciences Co., Ltd., Beijing, Kina), efterfulgt af RNA-koncentrationsbestemmelse. I henhold til instruktionerne fra one-step-metoden miRNA reverse transkriptionssæt (D1801, HaiGene, Harbin, Kina) og komplementært DNA (cDNA) reverse transkriptionssæt (K1622, Beijing Yaanda Biotechnology Co., Ltd., Beijing, Kina), RNA blev revers transkriberet til cDNA, med reaktionsbetingelserne som følger: ved 42 liter C i 30-50 minutter (revers transkription) og ved 85 liter C i 5 sekunder (revers transkriptaseinaktivering). CDNA ‘ en blev fortyndet til 50 ng/liter og derefter anvendt til RT-kpcr. Reaktionsforstærkningssystemet blev sat til 25 liter, med 2 liter tilsat hver gang. Et fluorescerende kvantificerings-PCR-instrument (ViiA 7, daangene Co., Ltd. med reaktionsbetingelserne indstillet som følger: præ-denaturering i 4 minutter ved 95 liter C, 30 cyklusser med denaturering i 30 sekunder ved 95 liter C, udglødning i 30 sekunder ved 57 liter C og forlængelse i 30 sekunder ved 72 liter C. to liter total cDNA blev brugt som et tempel, mens U6 blev betragtet som den interne kontrol. Den relative ekspression af de målrettede gener blev beregnet ved hjælp af 2-Kristct – metoden , hvor kristct = Kristct (Eksperimentgruppe) – kristct (kontrolgruppe) og kristct = Ct (målgener) – ct (U6). Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer for at opnå middelværdien (tabel 1).

tabel 1 Primersekvenser for RT

PD-L1 glycosyleringstest

for at fastslå, om PD-L1 blev glycosyleret, blev der anvendt et radioimmunpræcipitationsassay (RIPA) lysat (P0013B, Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina) på lyse FADU-og Cal27-celler, som derefter blev inkuberet med PNGase F (G5166-50un, Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA) og centrifugeret ved 12000 r/min for at ekstrahere proteinindholdet. Dernæst blev vestlig blot-analyse udført for at undersøge virkningerne forbundet med PNGase F på PD-L1. For at evaluere nedbrydningen af PD-L1 efter glycosylering blev tunicamycin (654.380, Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA) anvendt til behandling af cellerne. Derefter blev 20 liter cycloheksid (HY-12320, Medchemekspress, Medchemekspress, USA) tilsat til FADU-og Cal27-celler for at hæmme proteinsyntese. Proteinindholdsekstraktion blev udført ved 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h og 16 h, efterfulgt af vestlig blot-analyse for at evaluere ekspressionen af PD-L1. Endelig blev en nedbrydningskurve af PD-L1 afbildet .

Monouclear-celler i perifert blod (PBMC)-medieret kræftcelledrabsassay

efter blanding af interleukin-2 (IL-2) (20 IE ml-1) med Pbmc ‘er (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) blev hnscc-celler (1 liter 106) co-dyrket med Pbmc’ er (1 liter 107) i 4 dage efterfulgt af isolering af de aktiverede Pbmc ‘ er ved hjælp af Percoll densitetsgradient centrifugering. HNSCC-cellerne FADU og Cal27 blev mærket med CellTrace (Far Red, Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) og derefter dyrket med aktiverede Pbmc ‘ er i et medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) indeholdende humant CD3/CD28 tetramer-antistofkompleks i polystyrenrør (FALCON, Canada) i 48 timer ved 37 liter C med 5% CO2 i luft. Derefter blev cellerne skyllet med PBS, fikseret og permeabiliseret, efterfulgt af reparation med fiks/Perm-opløsning (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Cellerne blev derefter farvet med V450-spaltet caspase 3-antistof (560,627, fortyndingsforhold på 1: 50, Bd Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og analyseret ved hjælp af BD FACS Canto II (BD Immunocytometri Systems, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Hnscc-cellerne blev isoleret fra hnscc / PBMC-celleblandingen ved gating for CellTrace+. Endelig blev de aktiverede PBMC-medierede killer HNSCC-celler analyseret ved at detektere signalet fra den V450-spaltede caspase 3 .

dual-luciferase reporter genanalyse

syntetisk TCF-4 3′ UTR-genfragmenter blev introduceret i renilla luciferase reporter nedstrøms for psicheck2 vektor (Promega, Madison, Vi, USA) ved hjælp af SgfI og PmeI restriktionssteder. Derefter blev sekvenserne af den vilde type (vægt) og mutant type (MUT) i TCF designet, hvorefter målfragmenterne af vægt og MUT blev indsat i psicheck2-vektoren under anvendelse af T4 DNA-ligase. Derefter blev de korrekt sekventerede luciferase reporter plasmider TCF-4 3′-UTR vægt og TCF-4 3′-UTR MUT transficeret med let-7a/b til HEK-293 T-celler (CRL-1415, Shanghai Yu Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kina). Efter 48 timer blev cellerne opsamlet og lyseret i overensstemmelse hermed. Luciferase detection kits (Rg005, Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina) blev anvendt til at detektere den relative luciferaseaktivitet på glomaks20/20 luminometer fluorescens. Hvert forsøg blev udført i tre eksemplarer for at opnå middelværdien .

vestlig blot-analyse

celler i hver gruppe blev udvalgt, skyllet to gange med PBS efterfulgt af tilsætning af RIPA lysis buffer (indeholdende phenylmethansulfonylfluorid og phosphatasehæmmer) og kontinuerlig omrystning. Dernæst blev cellerne centrifugeret ved 12000 r/min i 30 minutter ved 4 liter C, med supernatanten opnået i overensstemmelse hermed. Efter bestemmelse af den totale proteinkoncentration ved anvendelse af Bicinchoninsyre assay kits (BCA) blev 50 liter proteiner opløst i 2 liter natriumdodecylsulfat (SDS) belastningsbuffer, kogt ved 100 liter C i 5 minutter, adskilt med 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE) og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved anvendelse af vådoverføringsmetoden. Membranblokade blev derefter udført i 1 time under anvendelse af 5% skummetmælkspulver ved stuetemperatur. Dernæst blev membranen inkuberet med primære antistoffer PD-L1 (ab213524, fortyndingsforhold på 1: 1000, kanin), krit-Catenin (ab32572, fortyndingsforhold på 1: 1000, kanin), t-cellefaktor 4 (TCF-4) (ab185736, fortyndingsforhold på 1: 1000, kanin), STT3A (ab242223, fortyndingsforhold på 1: 1000, kanin), STT3B (ab122351, fortyndingsforhold på 1: 1000, kanin) og krit-actin (ab8226, fortyndingsforhold på 1: 1000, mus). Alle ovennævnte antistoffer blev købt fra Abcam Inc. (Cambridge, Storbritannien). Efter tre skylninger med tris-bufret saltvand mellem-20 (TBST) blev membranen inkuberet med peberrodsperoksidase (HRP)-mærket sekundært antistof (eller gedemus eller gedemus, Beijing TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, Kina) i 1 time. membranen blev efterfølgende vasket igen med TBST 3 gange, udviklet ved hjælp af forbedret kemiluminescens (ECL) fluorescensdetekteringssæt (BB-3501, Amersham Pharmacia Biotech, Inc. Cambridge, UK) og fotograferet ved hjælp af Bio-Rad-Billedanalysesystemet (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Mængden en v4. 6.2 program blev anvendt til at analysere den relative proteinekspression, som blev udtrykt som forholdet mellem den grå værdi af de tilsvarende proteinbånd og det tilsvarende proteinbånd). Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer for at opnå middelværdien.

subkutane ksenograftmodeller i mus

C3H-musene (i alderen 6 uger, der vejer 18-22 g) blev købt fra Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd. Shanghai, Kina. I alt 1 liter 106 SCC7-celler indeholdende Luciferase i den logaritmiske vækstfase blev resuspenderet i 200 liter ren DMEM og derefter derefter injiceret i begge de ventrale sider af musene. Efter tumordannelse blev alle mus opdelt i 4 grupper baseret på injektion med normale scc7-celler, SCC7-celler, der overeksprimerer let-7a, normale scc7-celler kombineret med CTLA-4-antistof (BE0032, Bio-celle, 1 mg/ml) behandling og scc7-celler, der overeksprimerer let-7a kombineret med CTLA-4-antistofbehandling. Tumorstørrelsen blev målt ensartet hver 5.dag med tumorvolumen = L (længde) liter B (bredde)2/2. Musene blev derefter injiceret med D-Luciferin (122799-5, PE, 15 liter/mus) på den ventrale side, bedøvet under anvendelse af isofluran og observeret i overensstemmelse hermed. Tumorerne blev opsamlet 20 dage senere, og tumorens volumen og vægt blev sammenlignet og registreret. Tumor dissociation kits (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) og en tumor infiltrerende lymfocyt (TIL) gentleMACS dissociation instrument (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) blev anvendt til at forberede TIL og gradienten Percoll II væske (GE Healthcare, Bostan, USA). Densitetsgradientcentrifugeringsmetoden blev anvendt efterfulgt af isolering af TILs fra tumorsuspensionen og strømningscytometrianalyse. Tumorvævene I TIL uden isolering blev paraffinindlejret, sektioneret og underkastet immunofluorescensassay til PD-L1 ekspressionsanalyse (64.988, kanin, fortyndingsforhold på 1: 200, cellesignalering, Cellesignaleringsteknologi, Inc., MA, USA), CD8 (ab22378, rotte, fortyndingsforhold på 1: 200, Abcam, Cambridge, USA) og Gransym b (Af1865, ged, fortyndingsforhold på 1: 100, R&D-systemer, R&D-systemer, Minneapolis, MN, USA). Immunhistokemi blev endelig anvendt for at undersøge ekspressionen af TCF-4 .

Strømningscytometri

cellerne blev fremstillet til en enkelt cellesuspension og resuspenderet i farvningsbuffer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). FADU-og Cal27-celler blev behandlet med APC-PD-L1 (329.708, mus, fortyndingsforhold på 1:50, BioLegend, San Diego, CA, USA). Scc7-cellerne blev behandlet med BV421-PD-L1 (BioLegend, #124315, rotte. fortyndingsforhold på 1: 100), PerCP-CD3 (100,326, Armensk Hamster, fortyndingsforhold på 1: 100, BioLegend, San Diego, CA, USA), APC/Cy7-CD8a (100,713, rotte, fortyndingsforhold på 1: 100, BioLegend, San Diego, CA, USA) og fast og permeabiliseret Pacific blue-IFNy (505.817, rotte, fortyndingsforhold på 1: 50, BioLegend, San Diego, CA, USA). Endelig blev cellerne analyseret ved hjælp af et BD FACS Canto II strømningscytometer (BD Immunocytometri Systems, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og analyseret med strømning jo-programmet .

statistisk analyse

alle eksperimentelle data blev behandlet ved hjælp af SPSS 21.0 statistiske program (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Måledata blev udtrykt som gennemsnitlig standardafvigelse.

hvis dataene var i overensstemmelse med normalfordeling og homogenitet af varians, blev de parrede designet data mellem to grupper sammenlignet ved hjælp af en parret t-test og uparrede designet data med uparret t-test. Data mellem flere grupper blev sammenlignet ved envejsanalyse af varians (ANOVA) med en post-hoc-test udført ved hjælp af Tukey ‘ s. Data på forskellige tidspunkter mellem flere grupper blev analyseret ved hjælp af gentagne ANOVA-mål, hvor post-hoc-test blev udført ved hjælp af Bonferroni. Korrelationen mellem indikatorer blev analyseret ved Pearson analyse. En værdi på p < 0.05 blev anset for at være af statistisk signifikans.